Molekulární způsob genetický výzkum

Prozkoumat a identifikovat varianty, ve struktuře DNA, použité molekulárně genetické metody. Pro každou oblast DNA, která zkoumá tuto oblast chromozómu, gen nebo alely, metody se liší. Který je základem každého molekulárně genetické metody zahrnuje některé nebo jinou manipulaci s RNA a DNA. Všechny tyto metody se vyznačují obrovskou složitostí, aniž laboratorní podmínky nemohou být provedeny, a zaměstnanci musí být vysoce kvalifikovaní. Tato práce se provádí v několika stupních.

stupně

Za prvé, RNA nebo DNA vzorky, které mají být vyrobeny. Zde je molekulárně genetické metoda může být použita prakticky jakéhokoliv materiálu: kapku krve, leukocyty, fibroblasty kultury, sliznice (loupaný), dokonce i vlasové folikuly, - DNA může být získána z jakéhokoli vzorku. Je vhodné použít jakékoli molekulárně genetických metod a jejich různé varianty a již dlouho izolovaná DNA se uloží ve zmrazeném stavu. Druhý stupeň je určen pro hromadění požadovaných fragmentů (amplifikace DNA), protože pomáhá zajistit polymerázové řetězové reakce in vitro (in vitro bez zapojení živý organismus). Výsledkem je, že vybraný fragment DNA násobí této řetězové a vzroste množství DNA doslova miliónkrát.

Třetím krokem v molekulárně genetické výzkumu se předpokládá, vynásobený omezení DNA (tento fragmentaci, trhání nebo řezání). Omezení provádí elektroforézou na polyakrylamidovém nebo agarózovém gelu. Tato molekulárně genetická metoda studia DNA fragment umožňuje každému, aby se určité pozice v gelu. Potom se gel se zpracuje s ethidiumbromidem, který je schopen vázat se na DNA, ozařování ultrafialovým světlem, pak je možné pozorovat luminiscenční části. Molekulárně genetické diagnostické metody jsou různé a četné, ale první dva kroky jsou společné pro všechny. Aby však bylo možné identifikovat fragmenty DNA, gel může být barevné, a mnoho jiných stávajících metod.

druh

Mezi přímé a rozšířené metody pro detekci mykobakterií může obsahovat výše uvedené metody molekulární genetickou DNA učení. Jeho podstatou je to, že za účelem identifikace materiálu skenování řetězce specifických fragmentů DNA patogenů. Molekulárně genetické diagnostické postupy dosud nemají efektivnější způsob rozpoznat takových onemocnění je tuberkulóza. Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), může si být jistý, že původní DNA se zvýší počet kopií v miliónkrát, to znamená, že dojde k zesílení, a zobrazí výsledky. Úroveň citlivosti je velmi vysoká - více než devadesát pět procent, což je hlavní výhodou tohoto způsobu.

Zbytek molekulárně-genetických metod výzkumu o účinnosti výtěžku více kopií doslova zdvojnásobil, protože v tomto případě vypracování vzorek vykazuje specifickou oligonukleotidovou sekvenci zvýší na sto šestkrát. Dokonce i kultura diagnózu tuberkulózy dýchacího ústrojí výrazně snížit jeho citlivost. To je důvod, proč se moderní medicína vychází z molekulárně genetických metod diagnostiky tuberkulózy. Popisovanou metoda je účinná především při jednání s patogeny vysokou antigenní variabilitou, zjistit, že jiný způsob, jak je mnohem obtížnější - vyžaduje zvláštní živná média a kultivují dlouhou dobu. Biochemické a molekulárně genetické metody produkují velmi odlišný vliv na výsledky.

Diagnóza tuberkulózy

Marshall PCR diagnostiku tuberkulózy nejčastěji pomocí těchto sekvencí DNA, které jsou specifické pro všechny čtyři typy onemocnění. K dosažení tohoto cíle se často používají primery, které detekují sekvence je prvků (IS-986, IS-6110), neboť tyto prvky charakterizují vysoce stěhovavé druhy Mycobacterium tuberculosis a vždy k dispozici více kopií v genomu. Také extrakce DNA se může provádět z čistých kultur a klinické (sputu) kterýmkoli jiným vhodným způsobem. Například, tam, kde způsob Boom lyzační pufr se používá na základě thiokyanát guanidinu a oxidu křemičitého jako nosiče DNA. Počet pacientů, které se liší špatnou bakteriologických zvyšuje každý rok, a proto se v klinické praxi zavedl zcela odlišnou úroveň organizace: molekulárně-genetická metoda studia DNA hraje významnou roli v diagnostice.

Musíme však uznat, že to není bez nedostatků. Metoda PCR je použití často přináší obrovské množství falešně pozitivních výsledků, a důvodem je nejen technické chyby, ale také vlastnosti samotného způsobu. Navíc, pomocí této metody diagnostiky pro stanovení životaschopnosti mykobakterií, které byly identifikovány, je prostě nemožné. Ale tato nevýhoda není nejdůležitější. Molekulárně genetické metody diagnostiky PCR s sebou nesou riziko kontaminace mykobakteriální DNA. Požadavky na osvědčení pro tento důvod, že pro PCR laboratoře určeny výhradně tvrdě, oni vyžadují tři oddělené prostory. PCR technologie je moderní a velmi složité, vyžaduje použití vhodného zařízení a vysoce vyškolený personál.

bacterioscopy

Pokud výsledky diagnostiky analýzy musí být ve srovnání s jinými daty: klinické vyšetření, radiografie, stěru mikroskopie, plodiny a dokonce i jako odpověď na specifické léčby jsou velmi důležité. V této sérii, studie PCR je pouze jedna ze složek. Detekce patogenu v časné diagnostice mohou být nejjednodušší a nejrychlejší metody - bakteriologické.

Zde se používá světelného mikroskopu (zbarvení Ziehl-Neelsen) a fluorescenční barviva (fluorochromy). Výhodou je rychlost stěr výsledky. Ale jeho nevýhodou je právem považován omezená kapacita vzhledem k nízké citlivosti. Nicméně, tato metoda je vzhledem k doporučení Světové zdravotnické organizace jako nejekonomičtější a země odhalit pacienty tuberkulózy. Detekce mykobakterií bakteriologickou metodou má hodnotu predikce a odhadovanou kvantitativně bakteriální vylučování. Mnohem větší jistotu se s tím molekulárně genetických metod výzkumu tuberkulózy.

kultury

Lepší detekce mykobakterií rozpoznat kulturních studií. Výsev patologické materiálu je vyrobena do vaječné média: Mordovsky, Finn II, LJ, a podobně. Srovnávací testy rezistence mykobakterií na léky a nepřímé důkazy o účinnosti řady mykobakterií a jejich kolonie in vitro, pokud použité metody výzkumu kultury. Zvýšit procento izolace mykobakterií očkování patologického materiálu se koná na různých prostředích.

Uspokojování potřeb četné kulturní, patogenů, včetně dotace a tekutin. Používaný v tomto systému a automatizované typ měření růstu VANTES. Plodiny se musí konat v inkubaci po dobu až sedmi až osmi týdnů. Do této doby se plodina s nedostatkem růstu lze považovat za negativní. Nejúčinnější způsob pro detekci Mycobacterium tuberculosis v úvahu biologické vzorky: diagnostické materiál infikovat morčata, které jsou mimořádně citlivé na TB.

některá čísla

Zajímavé obor, který byl otevřen diagnostikou PCR bylo studium M. tuberculosis - latentní infekci. Moderní pojetí nákazy TBC naznačuje, že ze sta lidí, kteří byli v kontaktu s M. tuberculosis, devadesát může dobře být infikován, ale pouze deset z nich jsou aktivní onemocnění je vyvíjen. Jiní mají TB imunitu, a proto, že devadesát procent případů infekce zůstává latentní. Detekce vzoru to pomohlo molekulárně genetické metody.

Genetici říkají, že padesát pět procent z těch, jejichž plodiny patologický materiál byly negativní, a osmdesát procent lidí infikovaných M. tuberculosis, ale proudí bez radiografické projevy onemocnění, PCR pozitivní reakce obdržel. Je to genetická diagnostická metoda pomohla k identifikaci pacientů s rizikem PCR studiích s výsledky jejich analýz (mikroskopie a kultura) byly negativní, a subklinická infekce M. tuberculosis byl přítomen.

moderní výzkum

Ruská federace a bakteriologické laboratoře použít zrychlenou metodou absolutních koncentrací: nitrátreduktasu aktivity testovaných Griessova činidla mykobakterií. Anti-TB center použít způsob, který umožní určit lékovou rezistenci. Toto očkování v kapalném médiu, kde automatizované radiometrické a fluorescenční účetní systém růst mykobakterií. Taková analýza se provádí rychle - až dva týdny.

V současné době, nové metody jsou vyvíjeny: rezistence mykobakterií se měří na úrovni genotypu. Studium molekulárních mechanismů genů rezistence a ukazuje na přítomnost v mykobakterií. Tyto geny jsou spojeny s rezistencí vůči některých léků. Například geny Kasa, inhA, katG odolný vůči isoniazidu, rpoB genu - rifampicin RNA genů 16SP a rpsL - streptomycin, emb1 - na ethambutolu, gyrA - fluorochinolon, a tak dále.

mutace

Moderní diagnóza výrazně zvýšila metody molekulární genetické úrovni pro studium DNA a nechá se provádět rozsáhlé studie mutací v celé jejich spektrum. Nyní víme, že nejběžnější mutace v 516, 526 a 531 kodonů genu rpoB, a identifikovali odolnost proti různým léky. K dispozici je celá řada metod pro psaní mykobakterií za použití nejen tradiční metody - biochemické, biologické a kulturní, ale také široce používány moderní molekulárně genetických metod. Již existují dostatečné a poskytují správný způsob diagnózy pro detekci monogenní onemocnění. Jsou založeny na studiu DNA v přesné oblasti určitého genu. Toto je obvykle komplexní proces, časově náročné a nákladné, ale data, která je poskytována molekulárně genetické analýzy, je mnohem přesnější a informativní než data všech ostatních analýz.

Je již dlouho známo, že DNA se nemění po celou dobu životnosti organismu, že je v každém jaderných buněk odnakova, a to umožňuje, aby se na analýzu naprosto všech buňkách těla, v jakékoli fázi ontogeneze. Poškozený gen může být detekována před objevením se prvních příznaků do klinického onemocnění full-scale, stejně jako u zdravých heterozygotní lidí, ale mají mutaci v genu. Molekulárně genetické dědičné onemocnění diagnostické metody umožňují odhalit jeho (přímý přístup, DNA diagnostiku), jakož i pro analýzu segregaci onemocnění v rodině s markerem loci DNA (genetických polymorfismů), které jsou úzce spojeny s poškozeným genem (tj nepřímý přístup DNA diagnostika). Přímo nebo nepřímo - jakékoliv DNA diagnostika je založena na metodách identifikace přesně definovanou část lidské DNA.

přímé metody

Přímé metody DNA diagnostiky, jsou, pokud je dědičné onemocnění viník gen znám, jako dobře známé, a typy jeho mutací. Například se mohou použít vhodné přímé metody v řadě nemocí. Tato Huntingtonova chorea (prodlužovací CTG-repetice), fenylketonurie (R408W), cystická fibróza (delF508, hlavní mutace) a podobně. Hlavní výhodou přímé metody je zcela ve vlastnictví diagnostickou přesnost, a není třeba provést analýzu DNA zbytku rodiny. Pokud je nalezena mutace v odpovídajícího genu, umožňuje přesně schválit diagnózu dědičnosti, stanovení genotypu pro zbytek zatíženého rodiny.

Další výhoda přímé diagnózy je považována za identifikaci heterozygotní nosič špatných mutací od příbuzných a rodičů, kteří zemřeli na tuto nemoc. To platí zejména u chorob autozomálně recesivní. Nevýhody přímé metody jsou k dispozici také. Aplikovat je, co potřebujete vědět přesně lokalizovat abnormální gen, exon-intron strukturu své spektra a jeho mutace. Ne všechny monogenní nemoci dnes obdrželi tyto informace. Informativnost přímé metody nelze považovat za úplný, protože jeden a tentýž gen může mít velký počet patologických mutací, která způsobuje rozvoj dědičných chorob.

nepřímé metody

Nepřímé metody v diagnostice DNA jsou použity vůbec, v ostatních případech, je-li k poškození genů, které nejsou uvedeny, ale pouze chromosomálně, nebo v případě, že diagnóza linie nedal výsledek (to stane, je-li gen komplexu molekulární organizace nebo velkého rozsahu, pokud existuje mnoho patologické mutace). Nepřímé metody prováděny Analýza oddělování polymorfních markerů v alelické rodině. Markery nalezené ve stejné chromosomální oblasti nebo místo, úzce souvisí s nemocí a představují delece nebo inzerce, bod substituce, opakování, a jejich polymorfismus je kvůli odlišné množství buněk v bloku.

Nejvhodnější pro nepřímé diagnózu považována mikrosatelitů a minisatellite polymorfismů, které jsou široce distribuovány v lidském genomu. jejich hodnota vyjádřená v vysokým obsahem informací, je-li k poškození genetické vzdálenosti mezi markerem a genem, není příliš velký. V posledně uvedeném případě se přesnost odhadu je určena do značné míry frekvence rekombinace mezi polymorfním markerem a poškození. Nepřímé diagnostické metody také povinné předběžný krok allele frekvencemi analyzovaného populační studie u pacientů a nosičů mutací, plus nutnost určení pravděpodobnosti rekombinace nerovnovážné a adhezních markerů a mutantních alel.

jiné metody

Krátké úseky RNA nebo DNA, stejně jako jediný gen vizualizované pod mikroskopickou studii nemůže být proto k identifikaci mutací potřebné molekulárně genetická diagnostika. Tam je „Human Genome Project“, jakož i další pokroky v molekulární genetice velmi rozšířil možnosti diagnostiky dědičných chorob - a to jak před a postnatální. Tyto metody mohou zajistit včasné odhalení a dělat predikce polynenasycené a monogenní onemocnění, jehož debut se koná v dospělosti. Bohužel, vzhledem k technickým možnostem molekulárně genetických studií, které se někdy nad rámec etických limity, které jsou stanoveny ve vztahu k dědictví, zejména při stanovení diagnózy je v dospívání a dětství.

Strukturální a numerické chromozomální abnormality jsou nejčastější příčiny onemocnění a rakoviny, a mnoho malformací. Chromozomální aberace je třeba určit, který je důležitý pro rodinné poradenství - posoudit prognózy, společně s reprodukčním rizikem budoucích těhotenství. Analýza chromozom je „zlatý standard“ genetické diagnostiky, ale je omezená. Pouze metody molekulárně genetické analýzy mohou udělat více, protože se používá technologie klonování na bázi fluorescenční značky, které jsou schopny jejich vysoké citlivosti pro identifikaci jemné chromozomální změny, které jsou nemožné detekovat klasických cytogenetických studií. Tyto techniky se stále více rozšiřuje naše diagnostické možnosti, když zkoumal, děti s mentálním postižením, mentální retardace, s mnoha jiných dědičných chorob.

zjištění

To je pro lidstvo velmi důležité byly genové struktury a funkce poznání, typy variability, schopnost detekovat dědičné onemocnění, k nimž došlo v souvislosti s rozvojem molekulární genetiky. jeho metody jsou zaměřeny na studium molekuly DNA -, a když to je normální, a když je poškozen. Příprava sekvencí deoxyribonukleové kyseliny nukleotidů (DNA) se rozprostírá ve stupních od obdržení vzorků pro identifikaci jednotlivých fragmentů. Izolace genomové DNA z buněk, omezení (přetržení), zesílení (klonování), elektroforéza fragmentů (oddělující jejich elektrický náboj a molekulovou hmotnost v agarózovém gelu). Identifikace specifických fragmentů se nachází na povrchu diskrétní pruh.

Pak se dostat do zákona speciálních filtrů, přes které prochází každou hybridizaci fragmentů s klonovaných fragmentů DNA nebo syntetické radioaktivních sond je ovládací prvek, který se bude rovnat každého testovaného vzorku. Pokud se změnit polohu nebo délku ve srovnání se sondou, pokud je nový fragment nebo zmizel - to vše naznačuje, že analyzovaný gen prošla restrukturalizaci v nukleotidové sekvenci. Existuje osm základních technik molekulární genetické studie: sekvenování (stanovení sekvence DNA), polymerázová řetězová reakce (zvýšení počtu sekvencí), příprava primerů známých genů, klonování DNA, produkci rekombinantních molekul odvozených proteinů kvůli rekombinantních molekul, vytvoření kompletní sadu (sbírka knihovna) klonované fragmenty, které byly získány pomocí omezení.