Fluorescenční mikroskopie: princip metody

Absorpce a opětovné emise světla dalších anorganických a organických kapalin je výsledkem fosforeskující nebo fluorescence. Rozdíl mezi jevy je doba trvání intervalu mezi absorpce a emise světelného toku. Dojde-li k fluorescence těchto procesů téměř současně, zatímco fosforescence - s určitým zpožděním.

historické informace

V roce 1852, britský vědec Stokes, poprvé popsána fluorescence. On představil nový termín jako výsledek experimentů s kazivce, které emitují červené světlo pod ultrafialovým světlem. Stokes zaznamenali zajímavý jev. Bylo zjištěno, že vlnová délka fluorescenčního záření je vždy větší než průtok excitačního světla.

Pro potvrzení hypotézy v 19. století tam bylo mnoho pokusů. Ty ukázaly, že různé vzorky fluoreskují pod vlivem ultrafialového světla. Mezi materiály, mimo jiné, byly krystaly, pryskyřice, minerální látky, chlorofyl, surové drogy, anorganické sloučeniny, vitamíny, oleje. Přímé použití barviv pro biologické testy začaly až v roce 1930

Fluorescenční mikroskopie: Popis

Některé z materiálů použitých v první polovině studií 20. století vykazovaly vysokou specifičnost. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Díky výkonu, který nemůže být dosaženo pomocí kontrastní metody, způsob fluorescenční mikroskopie se stala základním nástrojem v oblasti biomedicíny a biologického výzkumu. Stejně tak byly získány významné výsledky, a pro materiály.

? Jaké výhody způsob fluorescenční mikroskopie? Použití nových materiálů se stalo možné a výběr vysoce specifických buněčných submikroskopické komponenty. Fluorescenční mikroskopie může detekovat jednotlivé molekuly. Paleta barev umožnilo určit více položek najednou. I přes omezené prostorové rozlišení limitu difrakční zařízení, která zase závisí na specifických vlastnostech vzorku, identifikace molekul pod tuto hodnotu, je také docela možné. Různé vzorky po ozáření výstavní autofluorescence. Tento jev je široce používán v petrologii, botaniky, v polovodičovém průmyslu.

rysy

Studovat zvířecích tkání nebo patogeny často komplikované nebo příliš slabé nebo velmi silné nespecifické autofluorescence. Avšak hodnota ve studiích získává úvod do materiálových komponent vybuzených na specifické vlnové délce a emitující potřebnou intenzitu světelného toku. Fluorochromy působí jako barviva, které mohou nezávisle na sobě spojených s konstrukcí (viditelné nebo neviditelné). Proto mají vysokou selektivitu k cíli, a kvantový výtěžek.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescenční mikroskopie byl široce používán od nástupu přírodních a syntetických barviv. Jsou vlastnil některých profilů intenzita vyzařování a excitaci a zaměřen na konkrétní biologickými materiály.

Identifikace jednotlivých molekul

Často, v ideálních podmínkách, můžete se zaregistrovat samostatný prvek záře. Za tímto účelem, mimo jiné, že je nutné zajistit dostatečně nízká hlučnost detektoru a optické pozadí. Fluorescein molekula k neúspěchu kvůli fotovybělení může emitovat až 300 tisíc. Fotonů. Při 20% účinnosti zachycování procesu a může registrovat v množství asi 60 tis.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescenční mikroskopie založené na lavinové fotodiody nebo elektronické násobení, umožnil vědcům sledovat chování jednotlivých molekul přes druhého, a v některých případech dokonce minut.

složitost

Klíčovou otázkou ve prospěch potlačení optického šumu pozadí. Vzhledem k tomu, že mnoho z materiálů použitých při konstrukci filtrů a čoček vykazují určitou autofluorescence, úsilí vědců v počátečních fázích byly orientovány na výrobu součástí, které mají nízkou fluorescenci. Nicméně, následné pokusy vedly k novým závěrům. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Zejména bylo zjištěno, že fluorescenční mikroskopie, na základě úplného vnitřního odrazu, to umožňuje, aby se dosáhlo nízké pozadí a vysokou intenzitou excitačního světla.

mechanismus

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Principy fluorescenční mikroskopie, na základě úplného vnitřního odrazu je použití evanescentním vln nebo pomíjivý. To nastane na hranici mezi médii s různými indexy lomu. V tomto případě je světelný paprsek prochází hranolem. Má vysoký parametr indexu lomu.

Hranol přilehlé k vodnému roztoku nebo skla s nízkým parametrem. Pokud se paprsek světla směrovaného na ni v úhlu, který je více kritický, je paprsek zcela odráží od rozhraní. Tento jev, podle pořadí, způsobí nonpropagating vlny. Jinými slovy, generované elektromagnetické pole, které proniká do média s nižším parametr indexu lomu na vzdálenost menší než 200 nanometrů.

Exponenciálně zanikající vlna Intenzita světla by byl dostatečný k excitaci fluoroforů. Nicméně, vzhledem k jeho velmi malé hloubce, její objem bude velmi malý. Výsledkem je low-level pozadí a.

modifikace

Fluorescenční mikroskopie je založena na celkové vnitřní reflexi, může být prováděna s epi-osvětlení. To vyžaduje čočky s vysokou číselnou aperturou (alespoň 1,4, ale je žádoucí, aby se dosáhlo 1,45-1,6), a částečně osvětlené pole zařízení. Ta se dosahuje s malou velikostí bodu. Pro větší jednotnosti tenkým kruh, který je blokován prostřednictvím částí proudu. Za kritický úhel, po které dochází k úplnému odrazu, potřebujeme vysokou úroveň lomu ponorné média v objektivu a krycím skle mikroskopu.